Sergiy Kyrylenko

DR. SERGIY KYRYLENKO

Projekt: METASTEM - Metabolická signalizace a energetická homeostáze u lidských embryonálních kmenových buněk

Školitel: prof.Ing.Petr Dvořák

Hostitelská instituce: Biologický ústav, Lékařská fakulta MU

Země původu: Ukrajina

Země vědeckého působení: Finsko

Délka projektu: 33 měsíců

Panel: Life sciences

Abstrakt:

Aktuální návrh nabízí podstatný pokrok v pochopení, jak se energetická homeostáza podílí na udržení pluripotence u lidských embryonálních kmenových buněk (hESC). Cílem našeho výzkumu je prozkoumat vliv buněčných metabolických parametrů na udržování nediferencovaného stavu u hESC.
Praktickou částí práce je experimentálně definovat metabolické parametry, které mají podpůrný vliv na udržení nediferencovaného stavu hESC, jelikož současné kultivační technologie nepostačují   dlouhodobé propagaci xeno-free hESC určených pro využití v klinické medicíně. Naše hlavní hypotéza je: Energetická homeostáza spolu s metabolickou signalizací definuje, nebo alespoň podstatně ovlivňuje, celkové buněčné signální kaskády u hESC. Naše pracovní hypotéza je: hESC získávají energii glykolýzou. Buňky v průběhu diferenciace mění metabolismus z glykolýzy na oxidativní fosforylaci. Předpokládáme, že metabolismus se postupně mění na oxidativní fosforylaci také v buňkách procházejících fenoménem adaptace na kultivační prostředí. To znamená, že intervencemi zaměřenými k udržení energetického metabolismu u hESC ve formě glykolýzy dosáhneme podpory pluripotence. Výzkumných cílů bude dosaženo prostřednictvím systematického zkoumání hlavních metabolických parametrů, zejména intracelulárního a extracelulárního NAD+, NADH a jejich vzájemného poměru, ATP, laktátu, ROS, systému transportu elektronů přes plasmatickou membránu, spolu se spotřebou kyslíku na buněčném povrchu, atd. u nízkých, středních a vysokých pasáží hESC a jejich diferencovaných protějšků. Hypotézy budou potvrzeny záměrnými změnami některých metabolických parametrů a prozkoumáním fenotypových následků těchto zásahů. Bylo dohodnuto s hostitelskou institucí, že žadatel si založí vlastní výzkumnou skupinu a vybuduje úzkou spolupráci ve formě subprojektů s výzkumnými institucemi ve Finsku, Německu, Ukrajině atd. na základě svých vlastních, již navázaných kontaktů.

Dosavadní průběh projektu:

Stručné shrnutí cílů projektu:

Jak jsem již dříve uvedl ve svém výzkumném plánu METASTEM, snažíme se zjistit, jak se metabolismus, speciálně energetická homeostáza, uplatňuje při udržení pluripotentního stavu a při diferenciaci lidských embryonálních kmenových buněk (hESC). Pro dosáhnutí těchto cílů byla vytvořena nová výzkumná skupina, dále spolupracujeme také s několika zahraničními laboratořemi a samozřejmě blízce spolupracujeme s dalšími členy naší laboratoře. Ucházíme se také o externí finanční podporu, snažíme se publikovat naše výsledky a rozšiřujeme naše znalosti.

Stručné shrnutí aktivit, které byly v rámci projektu realizovány za příslušné období od začátku projektu:

Nejprve jsem zoptimalizoval kultivační podmínky pro hESC rostoucí v souvislé vrstvě, které by byly použitelné pro jejich kultivaci na více-jamkových kultivačních destičkách. Dále jsem podstatně zlepšil reprodukovatelnost experimentů hESC v souvislé vrstvě tím, že jsem vypracoval nový protokol pro zmrazování buněk a jejich skladování v tekutém dusíku. Vynaložil jsem velké úsilí pro vytvoření nové výzkumné skupiny. Společně jsme vyvinuli řadu biochemických testů k měření metabolických parametrů hESC. Několik metabolických parametrů jsme již měřili. Vytvořili jsme nový nadějný buněčný model, který je použitelný pro studium role FGF2 v hESC v souvislosti s jejich metabolickým stavem. Zkonstruovali jsme řadu regulovatelných vektorů pro nadměrnou expresi různých izoforem lidského FGF2. Dále jsme použili několik metod pro vyvinutí podmínek pro přechodnou i stabilní transfekci hESC. Aktivně jsme spolupracovali s našimi i zahraničními spolupracovníky. Během uplynulého roku jsem se zúčastnil dvou vědeckých setkání, na kterých jsem měl ústní prezentaci. Se svojí skupinou také usilujeme o získání výzkumného grantu od IGA ČR ve spolupráci s Fakultní nemocnicí Brno. Publikoval jsem také článek, ve kterém byla zmíněna podpora SoMoPro.
Stručné shrnutí hlavních doposud dosažených výsledků:

-    Vytvořeny vhodné podmínky pro kultivaci hESC v souvislé vrstvě ve více-jamkových kultivačních destičkách;
-    Zmrazovací/rozmrazovací protokol byl upraven pro hESC kultivované v souvislé vrstvě, data jsou nyní připravována pro publikování;
-    Vypracovány podmínky pro účinnou stabilní transfekci hESC;
-    Byly připraveny stabilní hESC klony, které nadměrně exprimují GFP a tetracyklinový transaktivátor (rtTA);
-    Zkonstruovali jsme řadu inducibilních vektorů pro nadměrnou expresi různých izoforem lidského FGF2;
-   Byla vyvinuta řada biochemických testů pro měření různých metabolických parametrů, např.: NAD, laktát, glukóza, ATP. Tyto testy rutinně používají moji studenti pro nacvičení jejich laboratorních dovedností. Naše testy budeme také publikovat;
-    Měřili jsme řadu metabolických parametrů u hESC;
-    Ukázali jsme, že hESC aktivně tvoří laktát, který je exportován do buněčného média    ;
-    Vytvořili jsme nadějný model pro studium role FGF2 v souvislosti s metabolickými parametry buněk;
-  Ve spolupráci s Technickou univerzitou Berlín byla vyvinuta technologie pro měření určitých intracelulárních      metabolických parametrů přímo metodami kapalinové chromatografie;
-  Byla zahájena spolupráce s Rockefellerovou univerzitou v New Yorku v souvislosti s projektem pro vytváření humanizovaných myší;
-    Byla založena nová výzkumná skupina
-    Dosažené výsledky byly dvakrát prezentovány na mezinárodním výzkumném setkání;
-    Ve spolupráci s Fakultní nemocnicí Brno byla podána žádost o finanční podporu;
-    Publikován vědecký článek, kde byla zmíněna podpora SoMoPro

Shrnutí předpokládaných výstupů projektu a jejich potenciální dopad a využití:

V průběhu roku jsme s mou vědeckou skupinou vypracovali techniky, se kterými jsme seznámili i jiné výzkumné skupiny, a které jsou již používány v celé laboratoři. Mezi tyto techniky patří nové protokoly pro zmrazování hESC v souvislé vrstvě, dále techniky pro stabilní i přechodnou transfekci hESC, atd. Důležité je, že na náš výzkum indukovatelné exprese v hESC nyní navazují další výzkumné skupiny. Kromě toho jsme vyvinuli řadu biochemických testů, které mohou být využity jinými skupinami. Vývoj těchto testů napomáhá našim studentům rozvíjet své schopnosti pipetovat. Věříme, že to bude mít v budoucnosti široký pozitivní dopad, zejména pokud jde o docenění důležitosti spolupráce s mladými studenty, jejich schopnosti bývají totiž často podhodnocovány. Velmi důležité je také, že naše biochemické testy plánujeme publikovat, což bude mít velmi pozitivní vliv na budoucí kariéry našich studentů.
Podařilo se nám také vyvinout velmi slibný model pro studium úlohy FGF2 ve spojení s intracelulárními metabolickými parametry, což podle našeho názoru povede k publikaci článků významných pro vědecký svět. Naše mezinárodní spolupráce s Technickou univerzitou v Berlíně již přinesla výsledky ve vývoji metod pro přímé měření určitých intracelulárních parametrů hESC pomocí techniky kapalinové chromatografie (HPLC). Metody se chystáme společně publikovat. Přednášel jsem na dvou mezinárodních vědeckých setkáních a následné diskuse nám pomohly rozšířit naše znalosti.
Prozatím se nám podařilo navázat spolupráci s Fakultní nemocnicí Brno, a požádali jsme společně o výzkumný grant pro projekt v oblasti biologie nádorových kmenových buněk. Pokud bude úspěšný, bude tento projekt mít dobré šance a umožní založit vedlejší biotechnologickou společnost v Jihomoravském kraji.

Průběžné publikovatelné shrnutí projektu II

Jak jsem již dříve uvedl ve svém výzkumném plánu METASTEM, snažili jsme se zjistit, jak se metabolismus, zejména energetická homeostáza, uplatňuje při udržení pluripotentního stavu a při diferenciaci lidských embryonálních kmenových buněk (hESC). Pro dosáhnutí těchto cílů byla vytvořena nová výzkumná skupina. Spolupracujeme také s dalšími výzkumnými skupinami Biologického ústavu, Ústavu chemie a Ústavu experimentální biologie (Loschmidtovy laboratoře) Masarykovy Univerzity, a také s kolegy z Univerzity ve Zlíně. Ucházíme se také o externí finanční podporu, snažíme se publikovat naše výsledky a rozšiřujeme naše znalosti.

Stručné shrnutí aktivit, které byly v rámci projektu realizovány

Pokračovali jsme ve výzkumu na liniích hESC pomocí technik, které jsme vyvinuly, a které jsem popisoval v předešlé zprávě. Vyvinuli jsme řadu biochemických testů k měření metabolických parametrů hESC. Dokončili jsme a plně charakterizovali sérii rekombinantních vektorů pro nadměrnou expresi 3 základních izoforem lidského FGF2. Dále jsme ve spolupráci s bostonským Biokin s.r.o. aplikovali in-silico metody pro vytvoření počítačového modelu testu pro měření NAD. Zjišťovali jsme nejen hladiny NAD u hESC, ale také u embroidních tělísek, diferencovaných do kardiomyocytů, které jsme získali od spolupracující skupiny našeho ústavu. Ve spolupráci s kolegy z Loschmidtových laboratoří jsme zkonstruovali řadu vektorů pro nadměrnou expresi různých izoforem lidského FGF2 v bakteriích a vyvinuli technologie pro purifikaci a stanovení biologické aktivity exprimovaného FGF2. Vytvořili jsme a purifikovali dvě varianty takového rekombinantního lidského FGF2 a stanovili jejich biologickou aktivitu v hESC. Během uplynulého roku jsem se zúčastnil zahraničních vědeckých konferencí, na dvou z nich jsem měl ústní prezentaci, na dvou jsem prezentoval poster. Co je také důležité, pod mým vedením byla obhájena jedna diplomová práce a zahájena jedna doktorská práce. Publikoval jsem také článek, ve kterém byla zmíněna podpora SoMoPro.

Stručné shrnutí hlavních doposud dosažených výsledků

-    Byly připraveny stabilní klony hESC, které nadměrně exprimují tetracyklinový transaktivátor (rtTA) regulovaný promotorem EF1a, který se ukázal jako méně citlivý k inhibici (narozdíl od promotoru CMV používaného dříve). Tyto jsou využitelné pro inducibilní expresi různých izoforem FGF2;
-    Vyvinuta technologie pro konstrukci lineárních rekombinantních sekvencí DNA nezávislých na přímé ligaci.
-    Ukázali jsme, že lineární rekombinantní molekuly DNA jsou pro bioinženýrství hESC vhodnější než tradičně používané plazmidové DNA
-    Zkonstruovali a otestovali jsme 7 inducibilních vektorů pro nadměrnou expresi různých izoforem lidského FGF2;
-  Dva z těchto vektorů ukázaly schopnost produkce rozpustných FGF2; -    Dvě varianty rekombinantního lidského FGF2 byly exprimovány pomocí technologické platformy EnBase
-    Tyto dvě varianty byly použity pro stanovení termodynamických vlastností lidského FGF2;
-    Zavedli jsme metodu RT-PCR pro měření FGF19 mRNA v hESC, splňující doporučení MIQE;
-    Ukázali jsme, že gen FGF19 je při diferenciaci hESC podstatně deregulován;
-    Byla vyvinuta řada biochemických testů pro měření různých metabolických parametrů, např.: NAD, laktát, glukóza, ATP. Tyto testy rutinně používají moji studenti pro nacvičení jejich laboratorních dovedností. Naše testy budeme také publikovat;
-    Byly měřeny metabolické parametry u hESC diferencovaných do kardiomyocytů přes embroidní tělíska;
-    Byl zkonstruován počítačový model biochemického testu pro měření NAD, ve spolupráci s Biokin s.r.o., Boston, USA;
-    Právě připravujeme rukopis pro publikaci našeho testu pro měření NAD a počítačového modelování biochemických mechanismů námi používané cyklické reakce;
-    Dosažené výsledky byly dvakrát ústně a dvakrát formou plakátů prezentovány na mezinárodních výzkumných setkáních;
-    Byla získána finanční podpora z programu Brno;
-    Byl publikován vědecký článek, kde byla zmíněna podpora SoMoPro

Shrnutí předpokládaných výstupů projektu a jejich potenciální dopad a využití

Výsledky naší práce na podmínkách kultivace hESC v souvislé vrstvě jsou již připravovány k předložení ve společném rukopisu.Brzy se také chystáme publikovat rukopis o bioinženýrských technikách u hESC. Máme bohaté zkušenosti s počítačovým modelováním komplexních biochemických reakcí, např. pro NAD cyklickou reakci, které plánujeme použít i v našich dalších testech, zejména pro měření laktátu a ATP. Naše dlouhodobá spolupráce s ukrajinskou Bila Tserkva Agrarian University přinesla již dva publikované články a další se připravuje pro publikaci. Dále, výzkum ve spolupráci s Loschmidtovými laboratořemi, zaměřený na získávání nových forem lidského FGF2 s lepší stabilitou, se také dobře vyvíjí. Věříme, že má tento projekt velice dobré šance stát se použitelným a komerčně hodnotným, pokud se jedná o zisk stabilních forem proteinu FGF2.