Peter Bystrický
Peter Bystrický
Projekt: LECARB - Interakce protein-sacharid: Podstata rozpoznávání patogenem
Školitel: doc. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D.
Hostitelská instituce: Národní centrum pro výzkum biomolekul, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita
Země původu: Slovenská republika
Země vědeckého působení: USA, Irsko
Délka projektu: 36 měsíců
Panel: Life sciences
Abstrakt:
Sacharidy hrají důležitou roli v mnoha biologických procesech jako buněčné rozpoznávání, signalizace, diferenciace, kancerogeneze a dalších. Interakce sacharidů s proteiny - lektiny jsou mimo jiné i prvním krokem adheze, invaze a infektivity patogenních bakterií. Projekt je zaměřen na detailní studii systémů lektin-sacharid, převážně novými metodami NMR, které doplní informace získané metodami rezonance povrchových plasmonů a mikrokalorimetrie. NMR je nejrobustnější metodou pro detailní strukturní studie molekul podílejících se na interakcích. Pokročilé metody NMR by měly poskytnout detailní informace o vazebném místě, identifikovat aminokyseliny lektinů a funkčních skupin sacharidového ligandu, které se účastní interakce, a další detaily. Tyto informace jsou velmi důležité pro efektivní navrhování nových léčiv. Navržený projekt bude těžit z dosavadních zkušeností studia interakcí lektin-sacharid prováděných v Národním centru pro výzkum biomolekul jinými fyzikálně-chemickými metodami a ze současného NMR přístrojového vybavení, které je v Centru k dispozici.
Dosavadní průběh projektu:
Projekt je zaměřen na studium lektinů, které mohou hrát klíčovou úlohu v primárním rozpoznávání hostitelského organismu patogeny. Hlavními cíli tohoto projektu pro období prvního roku bylo zkoumání interakcí lektinů se sacharidy pomocí metod nukleární magnetické rezonance (NMR) a měření a interpretace vhodných NMR spekter. Tyto cíle byly splněny. Lektin, který byl studován, pochází z bakterie Ralstonia solanacearum (RS lektin, RSL). Tento lektin byl vybrán jako dobrý modelový systém na základě jeho vlastností. Byly studovány interakce lektinu se sacharidovými ligandy metodou rozdílu v přenosu saturace (STD) NMR. Bylo provedeno velké množství STD experimentů (například STD experimenty s lektinem a L-fukosou - jako jeho nejsilnějším vázajícím ligandem, se směsí monosacharidů jako možných ligandů, experimenty rozlišující anomerní pozice s α-OMe-fukosidem a β-OMe-fukosidem, dvojice experimentů s L-galaktosou a D-galaktosou, série experimentů s mutanty tohoto lektinu a STD experimenty s trisacharidem krevní skupiny B, které zahrnovaly i 2D STD HSQC experiment (heteronukleární jednokvantové koherence)). Také byl proveden experiment využívající přenesený nukleární Overhauserův efekt (NOE). Interakce lektinu s fukosou byly dále zkoumány titracemi lektinu fukosou při měření relativně rychlých 2D 15N-1H HSQC spekter, které dávají protony do vzájemného vztahu s dusíkem. Takže bylo nutné izotopově označit lektin alespoň 15N. Změny pozice a intenzity některých krospíků ve spektru během titrace svědčí o jejich účasti v interakci. Dále tyto krospíky bylo třeba přiřadit určitému N-H páru. Namísto časově náročného kompletního přiřazení všech aminokyselin v sekvenci, jsme zvolili přiřazení pouze klíčových aminokyselin účastnících se na interakci, jak byly určeny z krystalové struktury komplexu lektinu s fukosidem. Příprava selektivně značeného lektinu, jeho jednobodových mutantů a měření jejich spekter v roztoku byla nezbytná pro částečné přiřazení párů vodík-dusík z lektinu. Byl proto připraven selektivně značený RS lektin na tryptofanech a jeho dva jednobodové mutanty za účelem usnadnění přiřazení tryptofanů v obou aktivních vazebných místech na lektinu.
Výsledky z dosavadních experimentů bylo potvrzeno, že RS lektin má mezi běžnými monosacharidy nejvyšší afinitu k fukose. NMR experimenty naznačují, že lektin váže stejně dobře oba α i β anomery volně redukující fukosy. Také bylo ukázáno, že tryptofany v obou vazebných místech se podílejí na interakci a čtyři z nich mohou být považovány za klíčová rezidua v interakci.
Dosavadní výsledky byly prezentovány před vědeckou komunitou na dvou konferencích. Další prezentace těchto výsledků je naplánována na celoevropskou sacharidovou konferenci The 16th European Carbohydrate Symposium (Eurocarb 16) a je připravována i jejich publikace jako plnohodnotný článek v některém vědeckém zahraničním impaktovaném časopise.