Archana Mishra
Archana Mishra
Projekt: WNT MEMBRANE - Proteomická analýza plazmatické membrány chronické lymfocytární leukémie
Školitel: Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.
Hostitelská instituce: Přírodovědecká fakulta MU, Ústav experimentální biologie
Země původu: Indie
Země vědeckého působení: Taiwan
Délka projektu: 24 měsíců
Panel: Life sciences
Abstrakt:
V návrhu projektu se snažíme identifikovat proteiny plazmatické membrány (PM) asociované s B-buňkami pacientů s chronickou lymfatickou leukémií (CLL), a nikoli se zdravými B-buňkami. Změny, které nastanou na PM u CLL buňky budou dále zkoumány na molekulární a funkční úrovni. Abychom získali vhled do komplexních změn membránových proteinů v průběhu CLL, máme v plánu provést srovnávací proteomické analýzy pomocí dvou proteomických metod - kvantitativní proteomiky plasmatické membrány a imunoprecipitací následovanou hmotnostní spektrometrií (IP / MS) pro vybrané membránové proteiny souvisejících s WNT dráhou (Ror1, Celsr1, Vangl2 a Frizzleds). Budou analyzovány plazmatické membrány B-lymfocytů (i) od zdravých /indolentních /progresivní pacientů, a (ii) stimulovaných s extracelulární stimuly. Předpokládáme, že pomocí proteomiky budeme schopni identifikovat některé receptory a efektorové molekuly, které propojí Wnt signální dráhu (kanonickou i nekanonickou) s progresí onemocnění CLL. . Věříme, že objasnění profilu extracelulární membránových proteinů bude mít zásadní význam pro popsání nových biomarkerů CLL. Zároveň může být na membránové proteiny přímo cílena léčba.
Průběžné publikovatelné shrnutí projektu
Náš projekt je zaměřen na studium molekulárních mechanizmů nekanonické Wnt signalizace u B lymfocytů pacientů s chronickou lymfocytární leukemií (CLL). K identifikaci proteinů plasmatické membrány (PM) leukemických buněk, které jsou pro B lymfocyty pacientů s CLL specifické, používáme zejména metodu kvantitativní proteomiky plasmatické membrány a imunoprecipitaci následovanou hmotnostní spektrometrií (IP/MS). Naším cílem je identifikovat a prokázat specifické proteomické modifikace ve formě komplexních změn membránových proteinů, které se objevují na plasmatické membráně u CLL buněk. Dále chceme (i) prozkoumat molekulární a funkční vztah těchto proteinů k nenkanonické Wnt signalizace nazývané planární buněčná polarita (Wnt/PCP) a (ii) prokázat navrhované kandidátní proteiny jako nové CLL biomarkery. Jako studijní materiál používáme plasmatickou membránu z B-lymfocytů od zdravých dárců a od pacientů s progresivní a indolentní formou CLL.
Shrnutí výsledků:
V uvedeném období jsme pracovali na vývoji efektivního protokolu pro extrakci plasmatické membrány z buněk MEC-1. Použili jsme komerční kit pro izolaci povrchových buněčných proteinů (Pierce Cell Surface Protein Isolation kit, kat. č. 89881; Thermo scientific) a zavedli jsme metody membránové proteomiky spolu s protokoly podle Peirce a Waita, 2009 pro úpravu membránových proteinů. Vzorky získané pomocí těchto metod a metod založených na hmotnostní spektrometrii byly identifikovány pomocí hmotnostního spektrometru qTOF. Z celkového množství analyzovaných proteinů tvořily membránové a s membránou asociované proteiny pouze 15-20%, zbylá část vzorku byla kontaminována proteiny jadernými, ribosomálními a cytosolickými. Nyní se pokoušíme zavést změny v jednotlivých krocích izolace membránových proteinů a zlepšit tak naše výsledky. Zkoušíme rovněž používat různe rozpouštěcí pufry, které rovněž můžou pomoci k větším výtěžkům membránových proteinů identifikovaných metodou q-TOF.
Dále jsme se věnovali popisu složení komplexů membránových proteinů tvořených z PCP proteinů u CLL buněk, což byl hlavní cíl navrhovaného projektu. Naše data ukázala, že několik membránových komponent Wnt/PCP signalizace je u CLL buněk silně pozitivně regulovaných (laboratoř V. Bryji, v publikaci). Následně jsme zdravé a maligní CLL B-lymfocyty podrobili analýze pomocí hmotnostní spektometrie. Doposud jsme úspěšně použili protilátky proti receptoru Ror1 (AF2000, R&D systems) a DVL3 (Santa Cruz, sc-8027) pro imunoprecipitaci endogeních vazebných partnerů u vzorků z pěti pacientů s CLL. Po úspěšné detekci pomocí LC-MS/MS Q-TOF (Waters) jsme identifikovali několik proteinů, které by se mohly opakovaně objevovat u CLL pacientů. Další výsledky a podrobnosti viz část 1.2.
Potencíální dopad a vužití projektu:
Na základě našich dosavadních výsledků navrhujeme dva přístupy ke studiu dané problematiky a k objasnění vývoje CLL. Za prvé - klinický přístup k analýze nových biomarkerů CLL zapojených do Wnt/PCP signalizace. Za druhé – prohloubení funkčních a molekulárních analýz vytipovaných kandidátních proteinů a důkaz jejich zapojení do regulaci Wnt/PCP signální dráhy, která vede k CLL u lidí. Dokázali jsme úspěšně použít pokročilé metody proteomiky: kvantitativní proteomiku a proteomiku imunoprecipitovaných komplexů spolu s „in solution digest“. Tyto metody byly použity pro studium CLL poprvé. Jsme přesvědčeni, že objasnění vlastností hlavních kandidátních proteinů bude mít zásadní vliv na jejich poznání a používání jako biomarkerů pro diagnostiku CLL, terapeutických agens a kandidátních proteinů pro vývoj nových léčiv. Věříme, že tento výzkum přispěje k pochopení a vylepšení terapeutických přístupů a následného zmírnění progrese chronické lymfocytární leukemie.